روش انجام تست رایت (Wright Test) برای تشخیص تب مالت

تست رایت (Wright Test) یا آزمایش آگلوتیناسیون استاندارد (SAT) یک روش سرولوژیک کمی است که برای تشخیص تب مالت (بروسلوزیس) به کار می‌رود. این آزمایش وجود و میزان آنتی‌بادی‌های ضد Brucella را در سرم خون بیمار اندازه‌گیری می‌کند. با اینکه تست‌های جدیدتر و حساس‌تری نیز وجود دارند، تست رایت همچنان به دلیل در دسترس بودن و هزینه نسبتاً پایین در بسیاری از آزمایشگاه‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. درک صحیح روش انجام و تفسیر نتایج این تست برای دانشجویان پزشکی و پرسنل آزمایشگاه ضروری است.

اصول انجام تست رایت

اساس تست رایت، واکنش آگلوتیناسیون (لخته شدن) بین آنتی‌بادی‌های موجود در سرم بیمار (در صورت ابتلا به تب مالت) و آنتی‌ژن‌های استاندارد Brucella معلق در محلول است. در این تست، سرم بیمار به صورت سریال رقیق می‌شود و سپس به هر رقت، مقدار مشخصی از سوسپانسیون آنتی‌ژن Brucella اضافه می‌شود. پس از انکوباسیون در شرایط معین، لوله‌ها یا پلیت‌ها از نظر وجود آگلوتیناسیون ماکروسکوپی بررسی می‌شوند. بالاترین رقتی از سرم که هنوز آگلوتیناسیون قابل مشاهده نشان دهد، به عنوان تیتر آنتی‌بادی گزارش می‌شود.

مواد و وسایل مورد نیاز

• آنتی‌ژن Brucella استاندارد: سوسپانسیون باکتری‌های Brucella کشته شده و استاندارد شده (معمولاً B. abortus یا B. melitensis) که توسط شرکت‌های معتبر تهیه شده باشد.
• سرم خون بیمار: نمونه سرم خون بیمار که به روش صحیح جمع‌آوری و آماده شده باشد. سرم باید فاقد همولیز و لیپمی باشد.
• محلول سالین فیزیولوژیک (0.85% NaCl): برای رقیق‌سازی سرم.
• لوله‌های آزمایشگاهی کوچک یا پلیت‌های میکروتیتر: برای انجام واکنش آگلوتیناسیون.
• پیپت‌های مدرج یا میکروپیپت‌ها: با دقت بالا برای برداشتن حجم‌های دقیق سرم و آنتی‌ژن.
• رولر میکسر یا شیکر آزمایشگاهی: برای مخلوط کردن محتویات لوله‌ها یا پلیت‌ها.
• انکوباتور: با دمای 37 درجه سانتی‌گراد.
• چاهک‌های سرامیکی یا وسیله روشنایی مناسب: برای مشاهده بهتر آگلوتیناسیون.

روش انجام تست (روش لوله‌ای )

1. آماده‌سازی رقت‌های سریال سرم:
   • تعداد 8 لوله آزمایش را در رک قرار دهید و آن‌ها را شماره‌گذاری کنید (1 تا 8).
   • به لوله اول، 0.9 میلی‌لیتر محلول سالین فیزیولوژیک اضافه کنید. به سایر لوله‌ها مقدار کمتری سالین (0.5 میلی‌لیتر) اضافه کنید.
   • مقدار 0.1 میلی‌لیتر سرم بیمار را به لوله اول اضافه کنید و خوب مخلوط کنید. این رقت ¹/₁₀ خواهد بود (0.1 میلی‌لیتر سرم در 1 میلی‌لیتر حجم نهایی).
   • مقدار 0.5 میلی‌لیتر از مخلوط لوله اول را بردارید و به لوله دوم منتقل کنید و خوب مخلوط کنید. این رقت ¹/₂₀ خواهد بود (0.5 میلی‌لیتر از رقت ¹/₁₀ در 1 میلی‌لیتر حجم نهایی).
   • این فرآیند انتقال 0.5 میلی‌لیتر از لوله قبلی به لوله بعدی و مخلوط کردن را تا لوله هفتم ادامه دهید. پس از مخلوط کردن لوله هفتم، 0.5 میلی‌لیتر از محتویات آن را دور بریزید تا حجم نهایی در لوله‌های دوم تا هفتم نیز 1 میلی‌لیتر شود. رقت‌های نهایی شما به صورت زیر خواهد بود:
     • لوله 1: ¹/₁₀
     • لوله 2: ¹/₂₀
     • لوله 3: ¹/₄₀
     • لوله 4: ¹/₈₀
     • لوله 5: ¹/₁₆₀
     • لوله 6: ¹/₃₂₀
     • لوله 7: ¹/₆₄₀
   • لوله هشتم (کنترل): به این لوله حاوی 0.5 میلی‌لیتر محلول سالین فیزیولوژیک، 0.5 میلی‌لیتر سوسپانسیون آنتی‌ژن Brucella اضافه کنید (بدون سرم بیمار).
2. افزودن آنتی‌ژن:
   • به لوله‌های اول تا هفتم (حاوی رقت‌های مختلف سرم)، 0.5 میلی‌لیتر سوسپانسیون آنتی‌ژن Brucella استاندارد اضافه کنید.
3. انکوباسیون:
   • تمام لوله‌ها (1 تا 8) را به خوبی مخلوط کنید و در انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 18 تا 24 ساعت انکوبه کنید.
4. مشاهده و ثبت نتایج:
   • پس از انکوباسیون، لوله‌ها را به آرامی تکان دهید و در مقابل یک پس‌زمینه سفید و با نور مناسب، از نظر وجود آگلوتیناسیون ماکروسکوپی بررسی کنید.
   • آگلوتیناسیون به صورت لخته‌های قابل مشاهده از ذرات آنتی‌ژن که توسط آنتی‌بادی‌ها به هم متصل شده‌اند، ظاهر می‌شود.
   • لوله هشتم (کنترل) نباید هیچ گونه آگلوتیناسیونی نشان دهد.
   • بالاترین رقتی از سرم (در لوله‌های 1 تا 7) که هنوز آگلوتیناسیون واضح نشان دهد، به عنوان تیتر آنتی‌بادی گزارش می‌شود.به عنوان مثال، اگر تا رقت ¹/₁₆₀ آگلوتیناسیون مشاهده شود، تیتر ¹/₁₆₀ گزارش می‌گردد.

تفسیر نتایج

• تیتر پایین (< ¹/₂₀): معمولاً غیرتشخیصی است و ممکن است نشان‌دهنده عدم ابتلا، مرحله اولیه عفونت یا پاسخ ایمنی قبلی باشد. با این حال، در صورتی که بیمار علائم بالینی قویاً suggestive به تب مالت داشته باشد، حتی با وجود تیتر پایین یا منفی در تست رایت، انجام تست کومبس-رایت برای بررسی وجود آنتی‌بادی‌های بلوکه‌کننده توصیه می‌شود.
• تیتر متوسط (¹/₄₀ تا ¹/₈₀): ممکن است نشان‌دهنده عفونت در مراحل اولیه یا پاسخ ایمنی قبلی باشد و نیاز به تکرار تست در نمونه‌های بعدی و در نظر گرفتن علائم بالینی دارد.
• تیتر بالا (≥ ¹/₁₆₀ در مناطق اندمیک): همراه با علائم بالینی منطبق، قویاً مطرح کننده عفونت فعال تب مالت است.
• افزایش چهار برابر یا بیشتر در تیتر در نمونه‌های متوالی (با فاصله 2 تا 4 هفته): نشان‌دهنده عفونت فعال اخیر است.
• کاهش تیتر پس از درمان: نشان‌دهنده پاسخ به درمان است.

نکات مهم

• استفاده از آنتی‌ژن استاندارد و با کیفیت از شرکت‌های معتبر ضروری است.
• دقت در رقیق‌سازی سریال سرم بسیار مهم است.
• زمان و دمای انکوباسیون باید دقیقاً رعایت شود.
• تفسیر نتایج باید همواره با در نظر گرفتن علائم بالینی، سابقه بیمار و سایر یافته‌های آزمایشگاهی انجام شود.
• واکنش‌های متقاطع با آنتی‌بادی‌های ناشی از سایر باکتری‌ها (مانند Yersinia enterocolitica O:9) ممکن است منجر به نتایج مثبت کاذب شود.
• در موارد عفونت مزمن یا وجود آنتی‌بادی‌های بلوکه‌کننده، ممکن است تیتر تست رایت پایین باشد و نیاز به استفاده از تست‌های تکمیلی مانند تست کومبس-رایت باشد.

محدودیت‌ها

تست رایت دارای محدودیت‌هایی از جمله احتمال واکنش متقاطع و عدم توانایی در افتراق دقیق مراحل مختلف عفونت است. همچنین، در مراحل اولیه بیماری ممکن است نتایج منفی باشد. به همین دلیل، تفسیر نتایج باید با احتیاط و در کنار سایر یافته‌های بالینی و آزمایشگاهی صورت گیرد.